O-GlcNAc 修饰蛋白质组深度覆盖分析
发布时间: 2023-02-01 09:40:05
氧连接的氮乙酰葡萄糖胺（O-linked β-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰是一种由GlcNAc单糖通过β糖苷键连接于细胞内蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基的一种蛋白质糖基化修饰。在哺乳动物中，O-GlcNAc修饰受糖基转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和糖基水解酶（O-GlcNAcase，OGA）的调控，从而在调节转录、蛋白质稳态和压力响应等众多生物学过程中发挥重要作用。因此，建立一种简单、高效的O-GlcNAc组分析方法具有重要意义。为此，我们首先利用化学酶法标记氧连接的O-GlcNAc修饰蛋白，再通过生物正交的点击化学反应使被标记的O-GlcNAc 连接上生物素基团富集标签，蛋白酶解后使用偶联链霉亲和素的琼脂糖小珠对其进行富集，再利用紫外光切法高效释放O-GlcNAc 修饰肽段，经过色谱分离和质谱Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-ETD 模式鉴定与分析获得O-GlcNAc 修饰蛋白的修饰位点信息，从而实现位点特异性O-GlcNAc 修饰组的深度鉴定与表征。
应用领域
1、 O-GlcNAc 位点鉴定及定量分析；
2、氧糖基化蛋白质组深度表征、信号通路分析及糖蛋白标志物筛选。
技术优点
1、利用化学酶法标记-生物正交的点击化学反应富集效率高、选择性强；利用光切探针释放糖肽效率高，同时提高糖链末端伯胺基团的离子化效率；
2、质谱采集使用HCD-pd-EThcD，提高碎裂效率，得到更丰富的子离子信息；
3、在蛋白样品起始量≤ 2 mg，液质联用有效分离时长≤ 360 min条件下，单次检测鉴定O-GlcNAc 修饰位点数量≥ 3000个；不同批次检测鉴定O-GlcNAc 修饰位点覆盖度＞ 70%。
使用仪器
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-ETD
分析流程
1、利用化学酶法标记O-GlcNAc 修饰蛋白；
2、通过生物正交的点击化学反应使被标记的O-GlcNAc 连接上生物素基团富集标签；
3、蛋白质酶解后，对糖基化肽段进行富集与紫外光切割释放；
4、糖肽经液相色谱-串联质谱分析获得糖基化位点信息，并比较不同次制备的样品O-GlcNAc 修饰位点覆盖度，Mascot 等软件对质谱数据进行定性、定量分析。
可选数据分析
1、O-GlcNAc 修饰位点确认分析；
2、O-GlcNAc 修饰糖链的鉴定与定量分析；
3、氧糖蛋白GO 分析及差异蛋白GO 分析；
4、氧糖蛋白的Pathway 通路分析及差异蛋白的Pathway 通路分析；
5、重复性分析及多样品间表达模式聚类分析（适用于样本数≥3 的项目）。
起始样本量
蛋白提取物：约 2mg
参考文献
[1] Liu J, Hao Y, Wang C, et al. An optimized isotopic photocleavable tagging strategy for site-specific and quantitative profiling of protein O-GlcNAcylation in colorectal cancer metastasis[J]. ACS chemical biology, 2022, 17(3): 513-520.
[2] Liu J, Cheng B, Fan X, et al. Click-iG: Simultaneous Enrichment and Profiling of Intact N-linked, O-GalNAc, and O-GlcNAcylated Glycopeptides[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2023, 62(36): e202303410.
氧连接的氮乙酰葡萄糖胺（O-linked β-N-acetylglucosamine，O-GlcNAc）修饰是一种由GlcNAc单糖通过β糖苷键连接于细胞内蛋白的丝氨酸和苏氨酸残基的一种蛋白质糖基化修饰。在哺乳动物中，O-GlcNAc修饰受糖基转移酶（O-GlcNAc transferase，OGT）和糖基水解酶（O-GlcNAcase，OGA）的调控，从而在调节转录、蛋白质稳态和压力响应等众多生物学过程中发挥重要作用。因此，建立一种简单、高效的O-GlcNAc组分析方法具有重要意义。为此，我们首先利用化学酶法标记氧连接的O-GlcNAc修饰蛋白，再通过生物正交的点击化学反应使被标记的O-GlcNAc 连接上生物素基团富集标签，蛋白酶解后使用偶联链霉亲和素的琼脂糖小珠对其进行富集，再利用紫外光切法高效释放O-GlcNAc 修饰肽段，经过色谱分离和质谱Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-ETD 模式鉴定与分析获得O-GlcNAc 修饰蛋白的修饰位点信息，从而实现位点特异性O-GlcNAc 修饰组的深度鉴定与表征。
应用领域
1、 O-GlcNAc 位点鉴定及定量分析；
2、氧糖基化蛋白质组深度表征、信号通路分析及糖蛋白标志物筛选。
技术优点
1、利用化学酶法标记-生物正交的点击化学反应富集效率高、选择性强；利用光切探针释放糖肽效率高，同时提高糖链末端伯胺基团的离子化效率；
2、质谱采集使用HCD-pd-EThcD，提高碎裂效率，得到更丰富的子离子信息；
3、在蛋白样品起始量≤ 2 mg，液质联用有效分离时长≤ 360 min条件下，单次检测鉴定O-GlcNAc 修饰位点数量≥ 3000个；不同批次检测鉴定O-GlcNAc 修饰位点覆盖度＞ 70%。
使用仪器
Orbitrap Fusion Lumos Tribrid-ETD
分析流程
1、利用化学酶法标记O-GlcNAc 修饰蛋白；
2、通过生物正交的点击化学反应使被标记的O-GlcNAc 连接上生物素基团富集标签；
3、蛋白质酶解后，对糖基化肽段进行富集与紫外光切割释放；
4、糖肽经液相色谱-串联质谱分析获得糖基化位点信息，并比较不同次制备的样品O-GlcNAc 修饰位点覆盖度，Mascot 等软件对质谱数据进行定性、定量分析。
可选数据分析
1、O-GlcNAc 修饰位点确认分析；
2、O-GlcNAc 修饰糖链的鉴定与定量分析；
3、氧糖蛋白GO 分析及差异蛋白GO 分析；
4、氧糖蛋白的Pathway 通路分析及差异蛋白的Pathway 通路分析；
5、重复性分析及多样品间表达模式聚类分析（适用于样本数≥3 的项目）。
起始样本量
蛋白提取物：约 2mg
参考文献
[1] Liu J, Hao Y, Wang C, et al. An optimized isotopic photocleavable tagging strategy for site-specific and quantitative profiling of protein O-GlcNAcylation in colorectal cancer metastasis[J]. ACS chemical biology, 2022, 17(3): 513-520.
[2] Liu J, Cheng B, Fan X, et al. Click-iG: Simultaneous Enrichment and Profiling of Intact N-linked, O-GalNAc, and O-GlcNAcylated Glycopeptides[J]. Angewandte Chemie International Edition, 2023, 62(36): e202303410.
